LC实验

一、【实验目的】
1．了解并熟悉高效液相色谱仪的流程。
2．掌握液相色谱定性及外标定量方法。
3. 了解液相色谱检测器及色谱柱的分类。
二、【实验原理】
根据液相色谱分离理论：


其中 K为分配系数,  k'为容量因子，Vm。Vs分别为移动相和固定相的体积，p和q分别为组分在固定相和移动相中的重量。
苯，萘，联苯，菲分别属于单环，多环及稠环芳烃，且极性强度和分子量均有差别，因此，它们在强极性的流动相与非极性固定相之间的分配系数K就不同，保留时间也就不相同，混合样品因此而得以在色谱体系中被分离开。
由于苯，萘，联苯，菲都对紫外波长有吸收，因此选用紫外检测器进行检测。
在反相色谱系统里, 固定相是非极性的, 流动相是极性的。在化学键和相色谱中，固定相的配合基常是链长2-18碳原子的烷基。流动相一般为极性有机溶剂和水  的混合溶液。以溶质极性减弱的次序洗脱。随着移动相极性的增强。保留值亦随之增大。
反相色谱的分离是以溶质的疏水结构的差异为基础的，溶质极性越大，保留值越小，对于同系物，其保留值随碳数的增加而增大。
溶剂的组成对样品的保留有非常深刻的影响，溶质保留值的大小是随洗脱液的极性的降低而下降的，当流动相组成一定时, 样品在较长烷基配合基的固定相上的保留值较大。
在高效液相色谱中, 定性方法有已知标准物定性，保留值经验定性、用不同色谱体系定性、离析色谱峰后用其他方法定性等。本次实验采用已知标准物根据保留值定性的方法。
定量方法有归一化法、内标法、外标法等。本次实验采用外标法定量。
标准曲线法即外标法是配制已知浓度欲定量组分的标准溶液，测量各组分的峰高或峰面积，用峰高或峰面积对浓度作出标准曲线。将欲测组分置于与标准物完全相同的分析条件下操作，将得到的峰面积或峰高用插入法与标准物的校正曲线作对照，就可得到组分的浓度。
数据处理部分用专用色谱软件-色谱工作站来处理，可以方便的做到谱图自动积分、定量分析及分析自动化于一身。方便重复性操作。
高效液相色谱仪的主要部件：贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、数据处理系统等。

图为日立638-50型高效液相色谱仪

仪器流程：贮液器中贮存的载液（常需除气）经过过滤后由高压泵输送到色谱柱入口。当采用梯度洗提时一般需用双泵系统来完成输送。样品由进样器注入载液系统，而后送到色谱柱进行分离。分离后的组分由检测器检测，输出信号供给记录仪或数据处理装置。如果需收集馏分作进一步分析，则在色谱柱一侧出口将样品馏分收集起来。
各部分功能：
（1）高压泵：
往复式柱塞泵：是一种恒流泵，这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相；更换溶剂方便，很适用于梯度洗提；不足之处是输出有脉冲波动，会干扰某些检测器（如差示折光检测器），但对紫外检测器的影响不大。

（2）进样装置：
高压定量进样阀：这是通过进样阀（常用六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。
色谱柱：目前液相色谱法常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15~30cm的直形不锈钢柱。填料颗粒度5～10μm，色谱柱的填料种类主要有-C18、-C8、、-C6、-NH2、、-CN、-SO3-、-COOH、-NR3-、等等。
（3）检测器：
紫外光度检测器：紫外光度检测器是液相色谱法广泛使用的检测器，它的作用原理是基于被分析样品组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比耳定律。紫外光度检测器有固定波长（单波长和多波长）和可变波长（紫外分光和紫外可见分光）两类。下图是一种双光路结构的紫外光度检测器光路图：光源1一般常采用低压汞灯，透镜2将光源射来的光束变成平行光，经过遮光板3变成一对细小的平行光束，分别通过测量池4与参比池5，然后用紫外滤片6滤掉非单色光，用两个紫外光敏电阻接成惠斯通电桥，根据输出信号差（即代表被测样品的浓度）进行检测。
这种检测器的特点：
①灵敏度高
②最小检测浓度可达10-9g/ml
③对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提
④结构简单
⑤缺点是不适用于对紫外光完全不吸收的试样

溶剂的选用受到限制（有紫外吸收的溶剂不能用）。液相色谱检测器还包括示差折射率检测器、荧光检测器、库仑检测器等。
示差检测器是通过对物质的物理常数折光指数的测量来进行检测的，它是一种通用型检测器，但是，它的缺点是对温度变化非常敏感，不能用于梯度洗脱，
荧光检测器是通过检测被测物在一定波长紫外光激发下发出的荧光量来对被测物进行定量的，
并不是所有有机物都能发出荧光，在紫外光照射下会产生荧光的有机物，绝大多数为环状化合物，象某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类。维生素、石油高沸点馏分、生物碱、胆碱和甾族化合物等。
三、【实验条件】
色谱仪：日立638-50高效液相色谱仪。
色谱柱；spherisorb C18 5um [4.6ⅹ200mm]
流动相：甲醇：水=85：15
流速：1.0ml/min
检测器：UV-254nm
温度：室温
数据处理器：EChorm98色谱工作站。
苯、萘、联苯、菲的标准溶液浓度：0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml.
四、【实验步骤】
1.分别称取适量的苯、萘、联苯、菲标准品于100ml 容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度作为标准溶液。
2.取适量苯、萘、联苯、菲混和样品于100ml容量瓶中并用甲醇溶解至刻度作为未知样。
3.用超纯水（经0.45μm滤膜过滤）和甲醇（色谱纯）配制成比例为85：15的混合溶液作为流动相。
4.首先打开主机总开关，然后依次打开紫外检测器，脱气器及色谱工作站的电源开关。
5.在主机的操作板上，打开手动开关。分别输入流速参数，浓度参数，压力上下限值，最后启动黄色的泵开关。将监视器定位在压力表上，观察压力值。
6.调整检测器波长在254nm处，然后定位零点。观察色谱工作站中色谱图基线情况。
7.待基线平稳后，用微量进样器分别取5ul标准溶液，由进样阀进样，同时记录色谱图和保留时间。
8.取未知样品5ul进样，记录色谱图和保留时间。
五、【数据处理】
1.根据得到的标准曲线色谱图与保留时间，在未知样品谱图中确定每个峰的归属。
2.用色谱工作站通过相应的色谱峰峰面积计算出标准曲线的回归方程和线性相关系数，
3.外标法计算出未知样品中待测组分的含量。
4.打印出相应的色谱图。
六．【注意事项】
1.要注意观察泵的压力值，如有异常，要及时停泵，
2.使用微量注射器时要注意取量的准确性，
3.注射样品至进样阀时，要将注射器推到阀的根部。
七．【报告要求】
1.认真书写实验目的，实验原理，与实验步骤。按照自己实验得到的数据来进行处理数据。
2.要字迹工整，图表清晰, 原始色谱图附上。
八．【问题讨论】
1.根据分离原理的不同，高效液相色谱法可分为几类？
2.高效液相色谱的定量方法有那几种？
3.流动相使用前需要做那些准备工作？
4.流动相还可以作为改变什么的参数呢？